产品货号：
SY0822
中文名称：
高效T7 RNA体外合成试剂盒
英文名称：
Histan T7 High Yield RNA Synthesis Kit
产品规格：
50T|100T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒使用T7 RNA聚合酶并以含有T7启动子序列的线型双链DNA为模板，以NTPs为底物，对启动子下游的DNA序列进行转录，高效合成单链RNA。转录时可在底物中加入修饰的核苷酸，制备生物素或染料标记的RNA。
本试剂盒可以合成长转录本以及短转录本，以1μg的模板投入量可以产生100～200μg的RNA，转录合成的RNA可用于诸如RNA结构与功能研究、RNA酶保护、探针杂交、RNAi、显微注射及体外翻译等多方面的下游应用。
图1．RNA体外转录过程
保存：-20℃，有效期2年。
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本试剂盒可以合成长转录本以及短转录本，以1μg的模板投入量可以产生100～200μg的RNA，转录合成的RNA可用于诸如RNA结构与功能研究、RNA酶保护、探针杂交、RNAi、显微注射及体外翻译等多方面的下游应用。
图1．RNA体外转录过程
| 组分 | 50T | 100T |
| T7 RNA Polymerase Mix | 100μL | 200μL |
| 10×Transcription Buffer | 100μL | 200μL |
| ATP(100mM) | 100μL | 200μL |
| CTP(100mM) | 100μL | 200μL |
| GTP(100mM) | 100μL | 200μL |
| UTP(100mM) | 100μL | 200μL |
| Control DNA Template(500ng/μL) | 10μL | 20μL |
保存：-20℃，有效期2年。
- 反应体系中须严格注意不要混入RNase。
- 实验器材（如：枪头、产品管等）注意严格使用RNase Free用品。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
- DNA模板制备
带有双链T7启动子的线性化质粒或PCR扩增产物都可以作为Histan T7 High Yield RNA Synthesis Kit体外转录模板，模板可以用TE缓冲液或Rnase free H2O溶解。
T7启动子序列：TAATACGACTCACTATAG*GG （注：G*为RNA转录的第一个碱基）- 质粒模板
将目的DNA插入含有T7启动子的质粒载体中，然后用限制酶进行处理，待完全线性化后进行纯化。
注：
① 环状质粒由于没有有效的终止，会转录出不同长度的RNA产物，为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化。
② 质粒线性化所选限制酶需要在启动子区域右侧、插入DNA片段的下游，且在插入DNA片段中无识别位点。选择的限制酶要能形成5’突出或者平滑末端。
③ 为了避免蛋白及盐离子等对体系的影响，质粒线性化后建议纯化后再作为模板进行体外转录。
图2．线性化质粒为模板体外转录过程 - PCR产物模板
带T7启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。首先将T7启动子序列(TAATACGA CTCACTATAGGG)加在有义链的上游引物的5’端，然后在高保真酶的作用下扩增含T7启动子的DNA模板，随后进行转录。PCR产物可以不经纯化直接作为模板，但纯化后会得到更高的RNA产出。
注：
① PCR产物作为模板，必须电泳确认产物的特异性及浓度，建议20μL反应体系投入2～5μL PCR产物。
② 为了得到更多高品质的RNA，推荐PCR产物胶回收之后再作为模板进行体外转录。
- 质粒模板
- RNA体外转录
- 试剂解冻
将T7 RNA Polymerase Mix短暂离心，置于冰上。解冻10×Transcription Buffer和核糖核苷酸（ATP、CTP、GTP、UTP），混匀并离心至管底，10×Transcription Buffer置于室温，4种核糖核苷酸置于冰上，备用。 - 室温装配转录反应
按下列体系配制反应体系成分 用量 终浓度 RNase-free H2O 至20μL - 10×Transcription Buffer 2μL 1× CTP/GTP/ATP/UTP (100mM each) 2μL 10mM each 模板DNA 1μg - T7 RNA Polymerase Mix 2μL -
注：
① 反应于室温配置。由于10×Transcription Buffer中含有亚精胺，低温下亚精胺浓度过高会引起DNA模板沉淀。
② 短转录本（<100nt），模板可使用2μg，转录时间增至4～8个小时。
③ 长转录本（>1000nt），建议使用质粒线性化模板进行转录。
④ 建议在PCR仪中进行反应，热盖打开，防止长时间导致反应液蒸发。
⑤ 反应产物可能有白色沉淀。这是反应过程中游离的焦磷酸与反应液中的镁离子形成焦磷酸镁，不影响后续实验。如想去除，添加EDTA即可消失。添加EDTA如果影响后续实验，也可以离心回收上清。
⑥ 使用试剂、容器等无RNase污染。 - 37℃孵育2个小时。
将上述反应液混合均匀，短暂离心至管底，37℃孵育2个小时。若转录本长度小于100nt，增加反应时间至4～8个小时。 - DNaseⅠ处理（可选）
反应完成后，每管加入2μL DNaseⅠ（RNase free），37℃孵育15min以去除模板DNA。
- 试剂解冻
- 产物纯化
转录后的RNA可以选用RNA Cleaner磁珠进行纯化，也可以采用酚/氯仿纯化法，氯化锂沉淀法或柱纯化等，以去除蛋白、游离的核苷酸。纯化后的RNA经电泳检测后可进行下游实验或存储于-80℃。- RNA Cleaner磁珠纯化法
提前将RNA clean beads从4℃取出，平衡至室温（约30min），并用RNase free H2O将转录产物稀释至50μL。
① 颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀，吸取2×磁珠（100μL）加入RNA样品中（50μL），用移液器吹打6次充分混匀。室温孵育5min，使RNA结合到磁珠上。
② 将样品置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心移除上清。
③ 保持样品置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 s，小心移除上清。重复此操作一次。
注：漂洗时使用的80%乙醇需要使用RNase free H2O新鲜配制，以防止引入RNase酶导致RNA降解。
④ 保持样品始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠5min。
注：磁珠开盖晾干时要避免过分干燥，如果磁珠出现龟裂，则提示磁珠过分干燥，此时RNA的洗脱效率会降低。
⑤ 将样品从磁力架上取出，加入22μL RNase free H2O，用移液器吹打6次以充分混匀，室温静置5min。
⑥ 将样品置于磁力架5min，待溶液澄清后，小心转移上清20μL至一个新的RNase free PCR管中。
注：建议转移上清时留2～3μL液体，以免吸到磁珠影响后续实验。得到的RNA极不稳定，建议尽快进入下一步。若要保存，请置于-80℃保存。 - 酚/氯仿纯化法
①向20μL反应混合物中，加入115μL RNase free H2O和l5μL 3M乙酸钠（pH5.2），混合均匀。
②用等体积的酚/氯仿（1:1）抽提一次，再用等体积的氯仿抽提2次，收集上清，并转移至新的RNase free EP管中。
③加入2倍体积的无水乙醇沉淀RNA。混合均匀后置于-20℃至少30min，以最大转速，4℃离心15min，收集沉淀。
④加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。
⑤ 用20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。 - 氯化锂沉淀法
采用氯化锂沉淀法，RNA长度要大于300nt，且浓度不能低于100ng/μL。
①向20μL反应混合物中，加入30μL RNase free H2O和30μL7.5M氯化锂。
②混合均匀后，置于-20℃至少30min，以最大转速，4℃离心15min，收集沉淀。
③加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。
④ 用20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。 - 柱纯化法
纯化前加入80μL RNase free H2O将产物稀释至100μL，再按柱纯化说明书进行纯化。
- RNA Cleaner磁珠纯化法
- RNA定量
- 紫外吸收法
游离核苷酸会影响定量的准确性，采用此方法前请先进行RNA纯化。然后通过测定产物的A260读数来确定RNA的产量。对于单链RNA，1 A260相当于40μg/mL，所以RNA的产量可以如下计算：A260×稀释倍数×40 = μg/mL RNA - 染料法
用RiboGreen染料进行RNA定量，游离核苷酸不会影响定量，可以对纯化或未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。
- 紫外吸收法
- RNA大小及质量检测
- 琼脂糖电泳法
为了确定RNA的大小，完整度以及质量，需要进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。 - Agilent 2100 Bioanalyzer检测法
2100可以用来评估RNA完整度及质量，它仅需要少量的RNA进行分析，高品质的RNA在电图上应呈现明显且锐利的峰。
- 琼脂糖电泳法
- 转录产物产量低
模板的质量与产量密切相关，实验组产量明显低于对照组，可能原因有：
① 实验模板中有抑制反应成分；
② 实验模板本身原因。
建议：
① 重新纯化模板；
② 确定模板定量以及其完整性；
③ 延长反应时间；
④ 加大模板投入量；
⑤ 尝试其它的启动子和RNA聚合酶。 - 短转录本产量低
转录起始片段短会抑制反应，转录产物小于100nt时，延长反应时间至4～8小时或增加模板量至2μg可以提高RNA产量。 - RNA转录长度大于预期
如果电泳显示产物条带大于预期大小，可能原因：
① 质粒模板可能没有完全线性化；
② 有义链3’端为突出结构；
③ RNA存在未完全变性的二级结构。
建议：
① 检查模板是否完全线性化，如有必要，额外进行线性化；
② 选择合适的限制性酶，避免产生3’突出端，或者用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶补齐后，再进行转录；
③ 使用变性胶检测RNA产物。 - RNA转录长度小于预期
如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能原因：
① 模板包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列；
② 模板中GC含量高。
建议：
① 降低反应温度（比如，30℃），有时降低温度可以增加转录长度，但会降低产量。或者尝试不同的RNA聚合酶进行转录；
② 若模板GC含量高，采用42℃进行转录反应，或者添加SSB提高产量及转录长度。 - 转录产物电泳拖尾
电泳过程中有拖尾现象，可能原因：
① 实验操作过程被RNase污染；
② DNA模板被RNase污染。
建议：
① 实验过程中使用RNase-free的枪头和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用RNase free H2O配制。
② 重新纯化模板DNA。
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